IVT（In Vitro Transcription）是mRNA生产工艺中最为关键的步骤。一个完善的IVT体系不仅能够提高产量、减少原材料消耗、降低生产成本，还能有效保证mRNA分子的完整性、加帽率以及dnaRNA杂质的含量等核心质量指标，进而降低后续纯化工艺的难度，在整个生产流程中起着承上启下的作用。

IVT反应的整体过程相对简单，标准的IVT体系主要包含DNA模板、T7 RNA聚合酶（T7RNAP）、NTPs、无机焦磷酸盐、RNase抑制剂以及反应缓冲液等关键成分。DNA模板作为mRNA转录的基础，通常是PCR产物或线性化质粒，含有T7启动子、5’UTR、CDS、3’UTR及Poly（A）等元件；NTPs作为mRNA的转录底物，可以通过替换为修饰核苷酸来优化mRNA的稳定性和免疫应答性；无机焦磷酸盐和RNase抑制剂作为辅助成分，前者可水解转录反应中生成的焦磷酸，从而提高反应效率，后者则用于抑制可能存在的RNase污染；而T7RNAP则是整个反应系统的核心酶，负责识别DNA模板并将其转录为mRNA。

除了模板的质量外，主要影响IVT效果的成分为T7RNAP和缓冲体系。T7RNA聚合酶对IVT体系的影响至关重要。在IVT反应中，T7RNAP能够识别T7启动子序列，并在结合到DNA模板后催化RNA的合成。与其他RNA聚合酶相比，T7RNAP具有高度特异性，能够无需额外的蛋白或辅因子即可完成转录，这使其成为体外mRNA生产的首选酶。例如，UBCAnnaBlakneyLab采用DOE方法探索IVT反应的各个参数如何影响常规mRNA与saRNA的产量及质量（包括完整转录本比例），发现温度对长片段saRNA的完整性有显著影响。

随着温度从20℃升高至42℃，saRNA的产量虽然增加，但其完整性在超过32℃时会迅速下降。因此，定向筛选适于低温转录的T7RNA聚合酶可能是优化saRNA完整性的新的研究方向。此外，针对T7RNAP的热稳定突变体，其在高温条件下的转录性能可显著降低3’端过度延伸导致的dsRNA，并且模板编码的poly（A）尾对3’端过度延伸也有一定的影响。

在生物医学领域，通过高效的FADS（荧光激活液滴分选）技术，瀚海新酶结合酶定向进化平台筛选出多种T7RNA聚合酶突变体，如耐热型和高活性型。这类技术不仅能提高转录效率，还能确保产品的一致性和纯度。这为mRNA疫苗和药物的开发提供了重要的支撑。

在IVT体系的优化中，除了高效的T7RNAP外，反应缓冲液的调配同样至关重要。IVT缓冲液通常包含多种成分，如盐类、pH缓冲剂、二价阳离子及还原剂等，这些成分的浓度和比例直接影响RNA聚合酶的活性、特异性和稳定性。研究表明，pH值和镁离子的浓度对IVT反应的影响尤为显著。

大多数RNA聚合酶在接近中性或略偏碱性的环境中活性最佳，而RNA则在中性或偏酸性条件下更为稳定。因此，选择合适的缓冲剂和pH值同样会影响最终IVT产物的质量。经验表明，pH在65-72范围内能够有效提升转录效率，而镁离子的最佳浓度范围通常设置在40-60mM，过高或过低都会影响mRNA的合成效率。为此，尊龙凯时也在持续探索最佳的缓冲液配方，以提高产量和质量。

尊龙凯时致力于提供全套mRNA疫苗与药物相关的高性能酶原料、化学底物、IVT试剂盒和质量控制试剂盒。凭借自主的质粒制备、IVT工艺开发、mRNA纯化、LNP包封及相关质检平台，尊龙凯时能够为客户提供全面的解决方案和工艺开发服务，加速新药的上市进程。

展望未来，尊龙凯时计划进一步分享mRNA相关技术的深入探讨与研究成果，期待与您开展更广泛的合作，共同推动生物医疗技术的进步。