### SV40转染人成骨细胞HFOB119培养指南

#### 一、细胞培养条件

细胞名称：SV40转染人成骨细胞HFOB119

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：DMEM/F12 + 0.3mg/ml G418 + 10% FBS

传代方法：首次建议按1:2比例进行传代

传代注意：在传代后2天更换培养基，使用无菌离心管收集培养液以便进行对照培养。如果结果不理想，请直接购买尊龙凯时的完全培养基。

#### 二、细胞处理步骤

收到细胞后，应培育至良好状态，并灌满完全培养液以封闭瓶口，这是运输细胞的最佳方法。首先，用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后放入超净台内进行无菌操作。将细胞瓶放入335℃、5% CO2的培养箱内静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行处理。显微镜下观察细胞生长情况，拍照保存不同倍数的细胞图像（建议拍摄40x、100x和200x的照片），前三天的照片是重要的售后依据；未提供照片的情况下默认细胞状态良好。（传代后建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自己配制的完全培养基进行对比培养，换液后适当松开瓶盖。）

#### 三、细胞培养步骤

a、细胞传代：如果细胞未超过80%汇合度，将培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基，放入335℃、5% CO2孵箱下培养；如果细胞密度超过80%，可进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于335℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，轻敲培养瓶后加入超过5ml的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，将悬液转移至15ml离心管中，在1000 RPM条件下离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2比例分瓶进行传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入335℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

b、细胞冻存：1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，首先弃去培养液，使用PBS清洗细胞；2）加入0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，待细胞收缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落，转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟；3）弃去上清，加入1ml的尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中；4）将冻存管直接放入-80℃冰箱，如果后期要转入液氮罐中，需在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转入。

c、细胞复苏：1）从液氮中取出细胞冻存管（请佩戴防护面具），迅速置入335℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；2）将细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟；3）弃去上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放入335℃、5% CO2培养箱中继续培养；4）次日更换新鲜完全培养基继续培养。

#### 四、注意事项

在运输过程中，部分细胞可能会出现脱落，这是正常现象。如脱落严重，可按以下方法处理：将培养瓶中的全部培养液收集至离心管，1000rpm离心5分钟，收集上清作为对照培养。沉淀细胞后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后加5ml完全培养基终止反应。再次离心，弃上清，加入1-2ml完全培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入335℃、5% CO2的细胞培养箱中。

#### 五、售后条款

1）细胞问题的重发情况：若细胞在运输途中遭遇问题（如细胞丢失、瓶身损坏、培养液严重泄漏），可申请重发；若细胞在48小时内出现污染，请提供真实实验结果，经核实后可重发；对于常温发货的细胞，若静置24小时后细胞存活率低于标准，需提供真实清晰的细胞状态照片，核实后可重发；若干冰发货的细胞复苏24小时后出现污染，亦可申请重发；若细胞活性问题需在7天内提供实验结果，用台盼蓝染色法鉴定，合格后可重发；收到当天及第2、3天拍照留存，若未 báo出现问题的，视为产品合格。对于4-7天内问题，需提供收到细胞前3天和问题发生时的照片以及详细操作步骤，经过技术人员判断后重发；若需责任共担，可协商处理或按合同价的50%重发。

2）细胞问题的不予重发情况：若由于客户造成细胞污染、操作不当、使用非推荐培养体系等情况，均不予以重发；同时，若细胞状态不佳且未提供前3天照片，未及时反馈等，均不总结为重发。