标记原理 在一定的pH范围内，生物素会选择性地与伯氨基（如N-末端及赖氨酸残基侧链）反应，形成稳定的酰胺键，从而与蛋白质偶联。结合生物素-亲和素系统，这种标记技术广泛应用于流式细胞术、荧光成像、蛋白质印迹和ELISA检测等领域，可以提高信号强度，获得更高的灵敏度。

生物素标记使用量的计算 生物素试剂的使用量依赖于待标记蛋白质的量和浓度。通过实验数据分析，我们发现对2mg/ml的抗体（IgG，150KD）使用20:1的生物素与抗体的分子比，可以达到最佳标记效果。其他蛋白的标记比例则可根据这一经验进行调整。例如，当标记1mg的蛋白（浓度约为2mg/mL）时，使用生物素和蛋白的比例同样为20:1，而生物素的摩尔浓度为10mM，其计算方法如下：

1. 计算所需生物素的物质的量n。

2. 计算所需生物素的体积V。

操作过程

实验前准备

1. 仔细阅读标记试剂盒的使用说明书。
2. 待标记抗体中不得含有BSA等其它蛋白；叠氮钠、甘氨酸、Tris或其他有自由氨基的添加物会在操作的第一步中去除。
3. 根据生物素标记使用量的计算公式计算所需生物素的量。
4. 提前20分钟取出试剂盒，使其各组分平衡至室温。
5. 超滤管浸润：向干燥的超滤管滤芯中加入500μL标记缓冲液，室温放置10分钟备用，在加入待标记物之前弃去标记缓冲液，整个标记过程中超滤管滤芯应保持湿润。
6. 用30μL DMF溶解0.1mg生物素，静置10分钟，待其充分溶解，此时生物素的浓度为10mM，盖好管子备用。

标记流程

标记步骤（以下为1mg抗体的标记操作步骤）

1. 取1mg待标记抗体于超滤管中，并加入不超过超滤管最大体积的标记缓冲液，12,000g离心3分钟；可以重复此步骤3次。最后一次超滤完成后，加入0.5mL标记缓冲液将抗体浓度调整至约2mg/mL。
2. 将133μL的10mM生物素加入超滤管中，轻轻混匀后放入37℃恒温箱中避光孵育30分钟。
3. 以12,000xg离心10分钟。
4. 向超滤管中加入适量的1×PBS，轻轻混匀后以12,000g离心3分钟，重复此步骤3次。
5. 收集超滤管中的溶液（即生物素标记的抗体），加入0.2mL的1×PBS，轻轻混匀。将超滤管倒置于另一个收集管中，以8000×g离心5分钟，收集管中的溶液即为生物素标记的抗体。纯化后的抗体可采用A280或BCA法测定蛋白浓度。
6. 向标记后的抗体中加入保存液，并在-20°C保存。

注意事项

1. 选择适合待标记蛋白分子量的试剂盒，本试剂盒来自尊龙凯时（货号：RE80002），提供50KD的超滤管。
2. 生物素易受潮水解失效，需密封存放于-20°C或-80°C，并在实验前转至室温平衡，防止水蒸气冷凝。
3. 溶解后的生物素最好一次性使用，如未使用完，可以密封存放于-20°C以内，但标记效率会降低。生物素助溶剂使用后需立即密封保存，以防潮。
4. 本试剂盒亦可用于其他含有游离氨基的蛋白标记，具体比例可根据待标记物中的可用氨基数量进行调整。
5. 推荐的生物素与抗体（150KD）的最佳分子比为20:1，以确保高效的标记，用户可根据实际情况进行优化。

产品特点

• 快速：整个过程最快仅需90分钟。
• 方便：本生物素标记试剂盒提供了全部所需试剂，生物素已活化可直接使用，超滤管离心脱盐，简化实验操作。
• 灵活性：适用于微量和大量标记，每支超滤管可标记0.1-1mg蛋白。
• 脂溶性：该试剂盒内生物素为脂溶性，适合于需要蛋白进入细胞膜反应的实验。