在之前的文章中，我们已经探索了慢病毒作为生物医疗中的一种重要工具，其能够有效将外源基因整合到宿主染色体中，实现长时间的基因表达。慢病毒适用于几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代细胞，这使其在基因传递方面展现出强大的优势和广泛的应用前景。接下来，我们将讨论如何在获得包装好的慢病毒后进行后续操作。

1. 病毒的储存

包装好的慢病毒建议分装后置于-80℃冰箱中保存，储存期限为六个月。若超过这一时间，建议在使用前重新测定其滴度。如果短期内（如3-5天）进行实验，也可以将其保存在4℃。在整个使用过程中，应尽量避免反复冻融，因其可能导致病毒滴度下降。可根据每次实验的用量进行适当分装。

2. 病毒的稀释

若需要稀释病毒，应先将病毒于冰浴中融化，然后使用PBS或不含血清的培养基均匀稀释。为保证病毒滴度，建议在3天内用完稀释液。

3. 预实验摸索慢病毒的最佳MOI

不同细胞对慢病毒的敏感性存在差异，因此在进行正式实验前，需要通过预实验确定慢病毒对特定细胞的感染复数（MOI）和最佳感染条件。例如，接种的细胞量、感染时的总体积以及换液的时间等，确保后续实验效果理想。

实验步骤：

第1天：将目标细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，在37℃、5%CO₂培养箱中过夜；第2天：根据文献参考的MOI设置梯度范围，通常为3-100。将从-80℃取出的病毒冰浴融化，假设病毒滴度为1×10⁸ TU/mL，根据MOI值计算每孔所需的病毒原液。

第3天：更换培养液。建议在病毒感染16-24小时后，将含有慢病毒的培养液替换为正常培养液，继续培养细胞。第4-5天：使用倒置荧光显微镜观察感染48小时后的细胞，估计感染效率，并根据情况确定合适的MOI值进行正式实验。

4. 正式感染实验

在确定了MOI值后，可以进行正式感染实验。以携带GFP荧光标记和Puromycin抗性的慢病毒感染细胞为例，操作步骤如下：

1. 第一天，将细胞以5-10×10⁴个/孔的密度铺板，37℃培养过夜。
2. 第二天，取出病毒并稀释至所需浓度，注意轻轻混匀。
3. 吸去细胞原有培养基，加入稀释好的病毒液并根据预实验结果决定是否添加Polybrene。
4. 感染16-24小时后，更换为新鲜培养基。
5. 继续培养48-72小时，根据需要收集细胞，检测目标蛋白表达。

5. 稳转株的构建

通过带有不同抗性的慢病毒感染细胞后，在含相应抗生素的培养基中存活的细胞可以筛选出稳定表达基因的细胞株。

1. 多克隆稳转株筛选：将抗生素浓度降低至维持浓度，并继续培养收集细胞进行鉴定。
2. 单克隆稳转株筛选：通过稀释培养，挑取单个细胞的克隆，扩大培养，选择具有单一性状的细胞株。

在整个过程中，确保筛选的抗生素浓度是经过预实验确认的最低全致死浓度。通过以上步骤，可以有效构建稳定基因表达的细胞株，推动生物医学研究的深入发展。

通过使用尊龙凯时提供的相关资源，研究人员可以提升实验效率，实现高质量的慢病毒介导基因传递，进一步加强基因治疗的研究与应用。